雙脫氧鏈末端終止法測序反應原理雙脫氧鏈末端終止法測序原理雙脫氧鏈末端終止法測序反應原理雙脫氧鏈末端終止法測序原理雙脫氧鏈末端終止法測序反應原理雙脫氧鏈末端終止法測序原理雙脫氧鏈末端終止法測序反應原理二新生鏈的熒光標記原理?早期采用同位素法標記新生鏈，因其具有放射性危害背景高等缺點而很快被熒光染料標記法所取代?熒光染料的熒光和散射背景較弱，提高了信噪比它們的激發光譜較接近而發射光譜均位于可見光范圍，且不同染料的發射光譜相互分開，易于監測，故在自動測序中得到廣泛應用二新生鏈的熒光標記原理?熒光染料標記法單色熒光標記法多色熒光標記法熒光標記引物法熒光標記終止底物法熒光標記引物法熒光標記終止底物法二新生鏈的熒光標記原理多色熒光標記法熒光標記引物法?定義將熒光染料預先標記在測序反應所用引物的端?組種熒光標記引物，其序列相同，但標記的熒光染料顏色不同?測序反應中，模板反應底物聚合酶及標記引物等按編號被置于支微量離心管中，四個測序反應分管進行，上樣時合并在個泳道內電泳。特定顏色熒光標記的引物則與特定的雙脫氧核苷酸底物保持對應關系?二新生鏈的熒光標記原理?熒光標記引物法熒光標記引物法原理二新生鏈的熒光標記原理多色熒光標記法熒光標記終止底物法?定義將熒光染料標記在作為終止底物的雙脫氧單核苷酸上?反應中將種分別用種不同的熒光染料標記，帶有熒光基團的在摻入片段導致鏈延伸終止的同時，也使該片段端標上了種特定的熒光染料?經電泳后將各個熒光譜帶分開，根據熒光顏色的不同來判斷所代表的不同堿基信息二新生鏈的熒光標記原理模板產物新生鏈的熒光標記原理二新生鏈的熒光標記原理熒光標記引物法和熒光標記終止底物法的異同點?都確定了種熒光染料與種所終止的片段之間的專對應關系?熒光標記引物法使熒光有色基團標記在長短不同的片段的端，可理解為熒光染料標記過程和延伸反應終止分別發生在同片段的兩端，且標記發生在引物與模板的退火過程中，而終止是發生在片段延伸過程中，兩者在時間上有定間隔?熒光標記終止底物法使標記和終止過程合二為，兩者在同時間完成?在具體操作中，前者要求四個反應分別進行，而后者的四種反應可以在同管中完成二新生鏈的熒光標記原理單色熒光標記法?也包括熒光標記引物法和熒光標記終止底物法?與多色熒光標記法不同的是單色熒光標記引物法和熒光標記終止底物法均需將四個反應分別在不同擴增管中進行，電泳時各管產物也分別在不同泳道中電泳二新生鏈的熒光標記原理單色熒光標記法與多色熒光標記法的異同點?均可分為熒光標記引物法和熒光標記終止底物法?單色熒光標記法需將四個反應分別在不同擴增管中進行，電泳時各管產物也分別在不同泳道中電泳?多色熒光標記引物法需將四個反應分別在不同擴增管中進行，電泳時可合并在同泳道中電泳?多色熒光標記終止底物法可將四個反應在同擴增管中進行，電泳時在同泳道中電泳三熒光標記的檢測原理?測序反應般以單引物進行聚合酶延伸反應，絕大多數產物均為單鏈?反應結束后，樣品經簡單純化處理就可以放置到自動測序儀中開始電泳?兩極間極高的電勢差推動著各個熒光液基因分析儀的基本結構二儀器各組成部分的功能主機功能具有自動灌膠進樣電泳熒光檢測等功能自動進樣器區功能?自動進樣器受程序控制進行三維移動，因負極電極和毛細管均固定不動，故許多操作如毛細管進入樣品盤標本孔中進樣電極和毛細管在電極緩沖液瓶洗滌液和廢液管中移動等均依靠自動進樣器的移動完成二儀器各組成部分的功能?電極為電泳的負性電極，測序過程中，正負極之間的電勢差可達伏，如此高的電勢差可促進分子在毛細管中很快泳動，達到快速分離不同長度片段的目的?樣品盤有孔和孔兩種，可次性連續測試或個樣本?電極固定螺母起固定電極及毛細管的作用。二儀器各組成部分的功能凝膠塊區功能?注射器驅動桿給注射器提供正壓力，將注射器內的凝膠注入毛細管中。在分析每個樣品前，泵自動沖掉上次分析用過的膠，灌入新膠?樣品盤按鈕控制自動進樣器進出?注射器固定平臺起固定注射器的作用?電極為電泳的正性電極，始終浸泡在正極緩沖液中二儀器各組成部分的功能?正極緩沖液閥當注射器驅動桿下移，將注射器內的凝膠壓入毛細管時，緩沖液閥關閉，以防止膠進入緩沖液電泳時此閥打開，提供電流通道?玻璃注射器儲存凝膠高分子聚合物以及在填充毛細管時提供必要的壓力?毛細管固定螺母固定毛細管?廢液閥在清洗泵塊時控制廢液流。二儀器各組成部分的功能檢測區功能?激光檢測器窗口及窗蓋激光檢測器窗口正對毛細管檢測窗口，從儀器內部的氬離子激光器發出的激光可通過激光檢測器窗口照到毛細管檢測窗口上。電泳時，當熒光標記鏈上的熒光基團通過毛細管窗口時，受到激光的激發而產生特征性的熒光光譜，熒光經分光光柵分光后投射到攝像機上同步成像。窗蓋起固定毛細管的作用，同時可防止激光外泄二儀器各組成部分的功能?加熱板電泳過程中起加熱毛細管的作用，般維持在?毛細管為填充有凝膠高分子聚合物的玻璃管，直徑為?，電泳時樣品在毛細管內從負極向正極泳動?熱敏膠帶將毛細管固定在加熱板上。激光檢測器檢測特征性的熒光光譜激光檢測器檢測特征性的熒光光譜測序圖測序圖二儀器各組成部分的功能微型計算機功能?控制主機的運行，并對來自主機的數據進行收集和分析。設置測序條件樣品的進樣量電泳的溫度時間電壓等，同步監測電泳情況并進行數據分析各類軟件功能?承擔數據收集序列分析及片段大小和定量分析等功能。其結果可由彩色打印機輸出三全自動測序儀的常見故障及維護毛細管電泳型測序儀平板電泳型測序儀電泳時儀器顯示無電流電極彎曲電泳時產生電弧其他電泳時儀器顯示無電流傳熱板粘住膠板其他毛細管電泳型測序儀的常見故障及維護?電泳時儀器顯示無電流?電泳緩沖液蒸發使液面降低，而未能接觸到毛細管?電極彎曲而無法浸入緩沖液中?毛細管未浸入緩沖液中?毛細管內有氣泡等?電極彎曲?安裝調整或清洗電極后未進行電極定標操作就直接執行電泳命令，電極不能準確插入各管中?運行前未將樣品盤歸位或雖然執行了歸位操作，但軸歸位尚未結束就運行軸歸位等毛細管電泳型測序儀的常見故障及維護?電泳時產生電弧?主要原因是電極加熱板或自動進樣器上有灰塵沉積?其他?測序結束后應將毛細管負極端浸在蒸餾水中，避免凝膠干燥而阻塞毛細管?定期清洗泵塊?定期更換電極緩沖液洗滌液和廢液管二平板電泳型測序儀的常見故障及維護?電泳時儀器顯示無電流?電泳緩沖液配制不正確?電極導線未接好或損壞?正極或負極鉑金絲斷裂?正極或負極的膠面未浸入緩沖液中?傳熱板粘住膠板?主要原因為上方的緩沖液室漏液二平板電泳型測序儀的常見故障及維護?其他?倒膠前應按照操作要求認真清洗玻璃板?配制凝膠時應注意膠的濃度含量尿素濃度等?倒膠時需注意不能有氣泡?將待測樣品加入各孔前，應使用緩沖液沖洗各孔，把尿素沖去，以免影響電泳效果四全自動測序儀的進展?等于年首次建立了種使用四種不同熒光分別標記四種不同堿基的方法?同年，建立了種使用單色熒光四甲基羅丹明作為標記染料的自動測序方法?平板法電泳是經典的電泳技術，具有樣品判讀序列長塊凝膠板上可同時進行多個樣品測序可達個的優點?毛細管電泳為近年來建立的種快速高效進樣量少靈敏度高的新技術，可測序列達到左右四全自動測序儀的進展單色熒光標記四色熒光標記平板型電泳毛細管電泳?芯片實驗室?縮微生物處理器，成功完成納升級標本的測序四全自動測序儀的進展縮微生物處理器結構示意圖第十四章全自動測序儀和蛋白質自動測序儀內容提要第節全自動測序儀工作原理雙脫氧鏈末端終止法測序原理二新生鏈的熒光標記原理三熒光標記的檢測原理二全自動測序儀的結構與功能儀器的組成二儀器各組成部分的功能內容提要三全自動測序儀的常見故障及維護毛細管電泳型測序儀的常見故障及維護二平板電泳型測序儀的常見故障及維護四全自動測序儀的進展五全自動測序儀的主要應用第二節蛋白質自動測序儀蛋白質測序儀的工作原理二蛋白質測序儀的結構及其各部件的功能三蛋白質測序儀的主要應用前言?了解生命現象解釋疾病的發生診斷和治療疾病，是生命科學的核心內容之?核酸和蛋白質是控制生命過程的兩種重要大分子，其結構或功能異常是導致遺傳性疾病或遺傳相關性疾病的主要因素或相關因素，是生命科學研究的主要對象前言?核酸分子攜帶生命活動的全套信息，其基本結構核苷酸的線性排列構成它的級結構?蛋白質的級結構是指構成蛋白質的基本單位氨基酸的排列順序，研究蛋白質的級結構是了解蛋白質功能的基礎第節全自動測序儀測序核苷酸序列?早期小片段重疊法通過測定序列來推測序列缺點既費時又不準確?世紀年代以后自動測序儀雙脫氧鏈末端終止法化學降解法優點操作簡單安全快速準確全自動測序儀工作原理雙脫氧鏈末端終止法化學降解法?都是根據在固定的點開始核苷酸鏈的延伸，隨機在個特定的堿基處終止，產生四組不同長度的系列核苷酸鏈，在變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳進行片段的分離和檢測，從而獲得序列?雙脫氧鏈末端終止法更簡便和更適合于光學自動探測，故在全自動測序儀中應用廣泛雙脫氧鏈末端終止法測序原理?利用的體外合成過程聚合酶鏈反應,?聚合酶的催化?以目的為模板?按照堿基互補配對原則?在引物的引導下單核苷酸聚合形成新鏈雙脫氧鏈末端終止法測序原理?普通的反應體系中，加入的核苷酸單體為種脫氧核苷三磷酸，結構示意圖雙脫氧鏈末端終止法測序原理?測序反應體系中，加入的核苷酸單體為,雙脫氧核苷三磷酸結構示意圖雙脫氧鏈末端終止法測序原理與相比，在脫氧核糖的位置上缺少個羥基，反應過程中雖然可以在聚合酶作用下，通過其磷酸基團與正在延伸的鏈的末端脫氧核糖發生反應，形成磷酸二酯鍵而摻入到鏈中，但它們本身沒有，不能同后續的形成磷酸二酯鍵，從而使正在延伸的鏈在此終止。雙脫氧鏈末端終止法測序原理據此原理分別設計四個反應體系，每反應體系中存在相同的模板引物四種和種如，則新合成的鏈在可能摻入正常的位置都有可能摻入而導致新合成鏈在不同的位置終止。由于存在與的競爭，生成的反應產物是系列長度不同的多核苷酸片段。雙脫氧鏈末端終止法測序原理雙脫氧鏈末端終止法測序反應原理雙脫氧鏈末端終止法測序原理雙脫氧鏈末端終止法測序反應原理雙脫氧鏈末端終止法測序原理雙脫氧鏈末端終止法測序反應原理雙脫氧鏈末端終止法測序原理雙脫氧鏈末端終止法測序反應原理雙脫氧鏈末端終止法測序原理雙脫氧鏈末端終止法測序反應原理二新生鏈的熒光標記原理?早期采用同位素法標記新生鏈，因其具有放射性危害背景高等缺點而很快被熒光染料標記法所取代?熒光染料的熒光和散射背景較弱，提高了信噪比它們的激發光譜較接近而發射光譜均位于可見光范圍，且不同染料的發射光譜相互分開，易于監測，故在自動測序中得到廣泛應用二新生鏈的熒光標記原理?熒光染料標記法單色熒光標記法多色熒光標記法熒光標記引物法熒光標記終止底物法熒光標記引物法熒光標記終止底物法二新生鏈的熒光標記原理多色熒光標記法熒光標記引物法?定義將熒光染料預先標記在測序反應所用引物的端?組種熒光標記引物，其序列相同，但標記的熒光染料顏色不同?測序反應中，模板反應底物聚合酶及標記引物等按編號被置于支微量離心管中，四個測序反應分管進行，上樣時合并在個泳道內電泳。特